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DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC

阅读:366        发?#38469;?#38388;:2019/6/20
 

       ADCC简介
 
  Fc区域主要介导以下三类活动:
 
  1.通过结合表达在Natural killer (NK)等免疫细胞表面上的FcγR(Fcγ receptors)激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)
 
  2.通过结合血清补体C1q激活补体依赖的细胞毒性作用(Complement-dependent?cytotoxicity,CDC)
 
  3.通过结合新生儿Fc受体(Neonatal Fc receptor ,FcRn)延长抗体半衰期。
 
  今天我们主要关注ADCC,其不仅是机体通过抗体清除被病毒或其他病原物感染细胞的主要途径,也是目前治疗性抗体发挥临床效果的(Mechanism of Action ,MOA)核心机制之一[1]。因此,对于抗体新药研发和改造,仿制药开发和研发过?#35752;?#25239;体质量及功能的?#27835;觶?#37117;离不开ADCC的检测。同时,在生物药和免疫调节药物的临床试验中,ADCC活力也是必须的ex vivo指标之一。在此,我们以ADCC检测为切入点,向大家展示珀金埃尔默的DELFIA技术平台是如何助力抗体制药的。
 
图片引用自参考资料[1]
 
  基于DELFIA技术的ADCC检测
 
  从细胞水平来说,ADCC本质上属于免疫细胞介导的杀伤。因此,常见的针对细胞杀伤(注意不是细胞活力)的检测方式,如经典的51Cr释放法,LDH检测,和Calcein 释放法等都可以用于ADCC检测。从原理上,这些方法可?#27835;?#30452;接的检测靶细胞在效应免疫细胞作用下的裂解程度,如51Cr释放法;和间接的检测效应细胞的活化,如NFAT-RE-luc报告基因法和监测剩余的细胞活力来评估细胞杀伤,如化学发光法等。间接法的缺点是不能直接模拟体内ADCC过程。利用DELFIA技术的DELFIA® EuTDA(货号AD0116)细胞毒法属于直接检测法,更能?#20174;矨DCC的MOA。与51Cr释放法形式类似,DELFIA® EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标?#21069;?#32454;胞。BATDA能迅速进入细胞,并在水解作用下形成亲水的TDA留在细胞内,并在靶细胞裂解下释放,和DELIFA Eu试?#26009;?#32467;合形成强荧光、稳定的螯合物EuTDA用于检测。更详细的原理介绍可参考我们的微信端公众号[2]和应用材料[3]。
 
图片引用自参考资料[3]
 
  作为放射性检测的替代方法,更为安全的DELFIA® EuTDA细胞毒法在ADCC活力检测中具有众多优势。相较于无法区分非特异死亡的LDH检测,EuTDA法不受效应细胞死亡和裂解的影响,?#26723;捅尘?#30340;同时提升了检测的窗口和稳定性。相较于Calcein,BATDA能有效标记脆弱细胞,迅速被细胞摄取和在细胞裂解下完成高效的释放,为ADCC检测提供了稳定的检测窗口和易于标准化等优势。同时,EuTDA细胞毒法不受效应细胞限制,灵活支持利用多种原代免疫细胞(如PBMC和NK细胞)和更为稳定的改造细胞系的ADCC检测。从检测模式上EuTDA方法为时间分辨荧光(Time-Resolved Fluorescence,TRF),因此拥有TRF本身的众多优势,包括不受来源于培养基和血清等的?#23576;?#33639;光干扰,高稳定性和重复性等。此外,靶向红外区的检测能有效避免检测样本来带的干扰,并为多重检测打下基础。最后,对自动化和小型化的支持已让EuTDA法逐渐成为大分子药物研发中ADCC检测的标准方法[4]。在此,我们通过几个经典案例向大?#21307;?#32461;基于DELFIA技术的ADCC检测是如何助力大分子药物研发的。
 
  单抗研发领域之Fc区域改造
 
  在此,我们向大?#21307;?#32461;抗体改造的先河研究[5]。在结构解析的基础上,该研究引入AlphaScreen高通量筛选平台,通过竞争法鉴定出FcγRIIIa高亲和力的Fc区域变体。AlphaScreen的亲和力结果进一?#25509;葿iacore SPR 确认。除了检测变体和FcγRIIIa之间的亲和力,AlphaScreen还用于确认变体和抑制性IgG受体FcγRIIb之间的亲和力,从而获得变体和RIIIa/RIIb的相对亲和力比值。结果显示A330L 突变和S239D/I332E相结合能提高对激活性FcγRIIIa的亲和力的同时?#26723;?#21644;抑制性受体FcγRIIb之间的亲和力,显著提升RIIIa/RIIb的相对亲和力比值(4->9, 针对Trastuzumab)。
 
  在亲和力筛选的基础上,研究利用DELFIA EuTDA-based cytotoxicity assay(货号AD0116)在细胞水水平探究变体对ADCC的提升。以不同FcγRIIIa基因型的PBMCs为效应细胞,Her2+ SkBr3为靶细胞,研究证明改造的变体能有效提升ADCC(2-3个数量级),与亲和力数据趋势一致(下图左)。进一步的研究证明变体能有效引发针对HER-2不同表达水平的细胞株的ADCC。针对几乎没有抗原表达的MCF7细胞系,变体依然具有客观的ADCC活力(下图右)。
 
  除了基因水平多态性外,Fc区域的糖基化也影响其和FcγR的亲和力。尤其是?#20197;?#31958;的缺失会提升IgG1和FcγRIIIa之间的亲和力。因此,除了突变外,改造Fc区域的糖基化修?#25105;?#26159;提升治疗性抗体ADCC活力的一个途径。以由罗氏研发的Lumretuzumab单抗(RG7116)为例[6]。RG7116一方面阻断HER3的激活并下调HER3的表达。进一步通过罗?#20808;パ以?#31958;修饰的GlycoMab技术改造,RG7116和FcγRIIIa之间的结合亲和力提高50倍。基于DELFIA技术的ADCC检测证明,糖基化改造显著提升RG7116的ADCC活力(下图左)。同时,对比不同HER3表达量的细胞系,研究清晰地表明HER3受体表达丰度和RG7116介导的ADCC活力之间的正相关联系(下图右)。在动物模型上,基于多种低免疫细胞浸润的小鼠皮下瘤模型,研究发现RG7116仅通过靶向HER3就能发挥抗癌作用。进一步利用高免疫细胞浸润的异种原位移植A549肺癌小鼠模型,研究证明糖基化改造有效提升小鼠的生存周期。临床?#40644;?#35797;验进一步证明RG7116的临床疗效。一方面,RG7116有效抑制了肿瘤细胞膜HER3的表达。同时,相较于未糖基化改造的抗体,RG7116升高外周NK免疫细胞的活化程度[7]。
 
 

       免疫治疗领域之首个PD-1抗体: Nivolumab
 
  虽然同是单抗药物,PD-1抑制剂与常见的靶向药物作用机制不同。PD-1抗体主要用于阻断PD-1?#25512;?#37197;体PD-L1的相互作用,而不是杀伤PD-1阳性细胞,也就是抗肿瘤效应细胞。在Nivolumab的体外表征?#27835;?#30740;究中,DELFIA Cell Cytotoxicity Kit(货号AD0116)被用于确认Nivolumab是否会诱导ADCC产生。以活化的PBMCs为效应细胞,高表达PD-1的CD4阳性细胞为靶细胞,研究人员确认IgG4亚型的nivolumab不会诱发ADCC效应[8]。后续的实验进一步证明nivolumab不能介导CDC,因此nivolumab的引入不会清除PD-1阳性细胞群体。除了nivolumab外,其他的PD-1单抗,包括默沙东的Keytruda、百济神州的BGB-A317及恒瑞的SHR-1210,都为弱ADCC活性设计。?#27426;?#21516;样是免疫检查点抑制剂,CTLA-4单抗Ipilimumab则需要其ADCC活性来杀伤Treg细胞发挥作用,强调了不同作用机制对抗体ADCC活性的要求也有区别[9]。
 
  ADCC活力的检测不仅能协助解析单抗药物的MOA,也推动对于NK细胞功能的研究及开辟新的抗肿瘤策略。作为成熟的细胞杀伤检测工具,DELFIA®  EuTDA(货号AD0116)细胞毒法不仅可用于评估抗体的ADCC和CDC活力,还能用于检测ACT,CAR-T和CAR-NK等疗法中免疫细胞的杀伤能力。为了助力免疫治疗的开发,我们近期推出“珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台”,加速您的研究和药物开发进程。
 
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       参考资料
 
  [1] Deyev SM, Lebedenko EN. Modern Technologies for Creating Synthetic Antibodies for Clinical Application.Acta Naturae. 2009 Apr;1(1):32-50.
 
  [2] 科研干货|免疫细胞如何杀伤肿瘤细胞. https://mp.weixin.qq.com/s/-jW77oFnXusb9h6e-AKQBg
 
  [3] A Simplified, Gentle Cell-Labelling Method for Non-Radioactive Cytotoxicity Assays. PerkinElmer application note
 
  [4] An Automated DELFIA ADCC Assay Method using a CD16.NK-92 Cell Line. Biotek application note
 
  [5] Lazar GA, et al.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.
 
  [6] Mirschberger C, et al. RG7116, a TherapeuticAntibody That Binds the Inactive HER3 Receptor and Is Optimized for Immune Effector Activation. Cancer Res. 2013 Aug 15;73(16):5183-94.
 
  [7] Meulendijks D, et al. First-in-Human Phase I Study of Lumretuzumab, a Glycoengineered Humanized Anti-HER3 Monoclonal Antibody, in Patients with Metastatic or Advanced HER3-Positive Solid Tumors.Clin Cancer Res. 2016 Feb 15;22(4):877-85.
 
  [8] Wang C, et al. In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo Toxicology in Non-Human Primates. Cancer Immunol Res. 2014 Sep;2(9):846-56.
 
  [9] Romano E, et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6140-5.
 
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